Принцип действия локализационной микроскопии (ЛМ)

Метод ЛМ был впервые продемонстрирован на практике в 2006 г. практически одновременно в трёх научных группах [1-3].

В основе метода лежит достаточно давно осознанная учёными возможность определения положения объекта (локализации) по его изображению с субдифракционной точностью. Это аналогично тому факту, что среднее случайной величины X можно определить с точностью, намного превышающей стандартное отклонение этой величины, нужно только получить выборку достаточно большого объёма.

Формулы для точности определения среднего случайно величины и точности локализации молекулы закономерно схожи:

где δ - точность определения среднего и локализация, σ - стандартное отклонение X или ширина изображения молекулы, а N - объём выборки или количество зарегистрированных фотонов.

Суть метода ЛМ заключается в создании условий, при которых молекулы красителя в образце флуоресцируют не одновременно, а по очереди. В таком случае их изображения в различных кадрах не перекрываются, что позволяет локализовать каждую молекулу с высокой точностью, ограниченной только соотношением сигнал-шум и количеством зарегистрированных фотонов.

Таким образом, накопив достаточное количество кадров и определив координаты всех молекул в них, можно построить карту распределения молекул флуорофора в образце (его изображение), которая будет иметь существенно лучшее (на практике до 10 раз) разрешение по сравнению с обычным флуоресцентным изображением образца.

Основной сложностью ЛМ является создание условий для разделения флуоресценции молекул во времени. Для этого существует несколько методик: использование экзотических фотопереключаемых или фотоактивируемых красителей (что существенно усложняет процесс окраски), переходами которых в активное состояние можно управлять при помощи света определенных длин волн, либо создание условий для обратимого перехода стандартных флуоресцентных красителей в долгоживущее «темное» состояние и спонтанного возвращения оттуда («мигания» флуорофоров), что существенно упрощает подготовку образца и схему эксперимента, однако накладывает некоторые ограничения на среду, в которой проводится эксперимент.

Оптическая схема установки

Для осуществления локализационной микроскопии (ЛМ) в широкопольный флуоресцентный микроскоп (AxioImager.Z1 от Carl Zeiss) были заведено излучение трёх лазеров, позволяющие создавать высокие плотности освещенности в фокальной плоскости (до 2.5кВт/см2). Для сбора света используется масляный иммерсионный объектив с численной апертурой NA=1.46. Регистрация сигнала осуществляется чувствительной EM-CCD камерой.

Аппаратная функция установки

При помощи квантовых точек в качестве тестового образца были определены аппаратные функции микроскопа в обычном режиме (слева) и в режиме локализационной микроскопии (справа). Проведенные измерения показали, что метод локализационной микроскопии на нашей установке позволяет увеличить пространственное разрешение более чем в 8 раз по сравнению с обычным флуоресцентным режимом.

ЛМ молекул ДНК, окрашенных интеркалирующим красителем YOYO-1

В качестве тестового образца для отработки метода локализационной микроскопии (ЛМ) нами были выбраны молекулы ДНК, выпрямленные на покрытом полистиролом покровном стекле и окрашенные интеркалирующим красителем YOYO-1. Линейность ДНК позволяет непосредственно определить разрешение как «толщину» изображения ДНК. На следующем рисунке приведены изображения ДНК в обычном и ЛМ-режимах.

Приведенные на рисунке профили изображений ДНК в обычном и ЛМ-режимах показывают, что в ЛМ-режиме наблюдаемая ширина ДНК в 4 раза меньше, чем в обычном режиме, что соответствует четырехкратному улучшению разрешения.

Полезные ссылки для ознакомления с методом ЛМ

• Три статьи, вышедшие в 2006 году и положившие начало ЛМ:

  • 1. Rust J. M., Bates M., Zhuang X. (2006) Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods. 3, 793-795

    2. Betzig E., Patterson G. H., Sougrat R., Lindwasser O.W., Olenych S., Bonifacino J. S., Davidson M. W., Lippincott-Schwartz J., Hess H. F. (2006) Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science, 313:1642-1645

    3. Hess S. T., Girirajan T. P., Mason M. D. (2006) Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys J, 91:4258-4272

• Статья, посвященная возможности использования стандартных флуорофоров для ЛМ:

  • 1. Heilemann M., Van de Linde S., Schuttpelz M., Kasper R., Seefeldt B., Mukherjee A., Tinnefeld P., Sauer M. (2008) Subdiffraction-Resolution Fluorescence Imaging with Conventional Fluorescent Probes. Angew. Chem. Int. Ed., 47:6172

• Статья, в которой продемонстрирована возможность ЛМ ДНК, окрашенной YOYO-1:

  • 1. Flors C., Ravarani C. N. J., Dryden D. T. F. (2010) Super-Resolution Imaging of DNA Labelled with Intercalating Dyes. Chem Phys Chem, 10:2201-2204

• Статья, описывающая используемую нами програму обработки изображений для ЛМ:

  • 1. Henriques, R.; Lelek, M.; Fornasiero, E. F.; Valtorta, F.; Zimmer, C. & Mhlanga, M. M. (2010) QuickPALM: 3D real-time photoactivation nanoscopy image processing in ImageJ. Nat Meth, 7, 339-340