Научные группы

Изучение механизмов работы систем CRISPR-Cas I типа

Описание исследований

Системы CRISPR-Cas являются системами адаптивного иммунитета прокариот и защищают клетки от бактериофагов. На этапе адаптации клетки встраивают фрагменты фаговой ДНК – спейсеры – в CRISPR-кассету в геноме. CRISPR-кассета транскрибируется с образованием коротких крРНК, каждая из которых содержит один спейсер. Белки Cas связываются с крРНК, образуя так называемый эффекторный комплекс, который распознаёт участки комплементарные спейсеру в крРНК и инициирует их расщепление. Этот процесс называется интерференцией.

Мы занимаемся изучением механизмов CRISPR-адаптации в бактерии Escherichia coli.

Основные публикации:

  1. Shiriaeva, A.A., Savitskaya, E., Datsenko, K.A., Vvedenskaya, I.O., Fedorova, I., Morozova, N., Metlitskaya, A., Sabantsev, A., Nickels, B.E., Severinov, K., et al. Detection of spacer precursors formed in vivo during primed CRISPR adaptation. Nature Communications, 2019, 10, 4603.

  2. Kurilovich, E., Shiriaeva, A., Metlitskaya, A., Morozova, N., Ivancic-Bace, I., Severinov, K., and Savitskaya, E. Genome Maintenance Proteins Modulate Autoimmunity Mediated Primed Adaptation by the Escherichia coli Type I-E CRISPR-Cas System. Genes, 2019, 10, 872.

  3. Shiriaeva, A., Fedorov, I., Vyhovskyi, D., and Severinov, K. (2020). Detection of CRISPR adaptation. Biochemical Society Transactions, 2020, 48(1), 257-269  (a review article with original experimental data).

Руководитель группы
Анна Ширяева, PhD
annabiologic@gmail.com

Анастасия Киселёва
Студент ИБСиБ, ВШБиПП

Юлия Цой
Студент ИБСиБ, ВШБиПП

Никита Ваулин
Студент ИФНиТ

Изучение CRISPR-Cas систем и применение их в биотехнологии

Описание исследований

CRISPR-Cas - защитные системы бактерий и архей, которые помогают им справляться с натиском бактериофагов и других мобильных генетических элементов. Работа этих систем основана на действии Cas нуклеаз - белков, в комплексе с направляющими РНК способными распознать геном бактериофага и внести в него разрыв. Это приводит к деградации генома вируса и прекращению распространения инфекции в бактериальной популяции.

Оказалось, что используя направляющие РНК конкретной последовательности можно направлять Cas нуклеазы на любые участки генома, как бактерий, так и эукариот (растений, животных и даже человека) и вносить в ДНК специфические разрывы. Такой подход можно использовать для генетической инженерии - направленного изменения генома для придания желаемых свойств организму.

CRISPR-Cas системы очень разные, их эволюция прошла долгий и уникальный путь.

Наша группа занимается изучением многообразия CRISPR-Cas систем и поиска новых способов их применения в биотехнологии.

Основные публикации:

  1. Fedorova, I.*; Arseniev, A.*; Selkova, P.; Pobegalov, G.; Goryanin, I.; Vasileva, A.; Musharova, O.; Abramova, M.; Kazalov, M.; Zyubko, T.; Artamonova, T.; Artamonova, D.; Shmakov, S.; Khodorkovskii, M.; Severinov, K. DNA Targeting by Clostridium Cellulolyticum CRISPR-Cas9 Type II-C System. Nucleic Acids Research, 2020, 48(4), 2026–2034. DOI: 10.1093/nar/gkz1225.

  2. Selkova,P.*; Vasileva,A.*; Pobegalov, G.; Musharova, O.; Arseniev, A.; Kazalov, M.; Zyubko, T.; Shcheglova, N.; Artamonova, T.; Khodorkovskii, M.; Severinov, K. and Fedorova, I. Position of Deltaproteobacteria Cas12e nuclease cleavage sites depends on spacer length of guide RNA. RNA biology, 2020. DOI: 10.1080/15476286.2020.1777378.

  3. Iana Fedorova*, Aleksandra Vasileva*, Polina Selkova, Marina Abramova, Anatolii Arseniev, Georgii Pobegalov, Maksim Kazalov, Olga Musharova, Ignatiy Goryanin, Daria Artamonova, Tatyana Zyubko, Sergey Shmakov, Tatyana Artamonova, Mikhail Khodorkovskii, and Konstantin Severinov, PpCas9 from Pasteurella pneumotropica - a compact Type II-C Cas9 ortholog active in human cells. Nucleic Acids Research, 2020 in press.

Руководитель группы
Яна Фёдорова, PhD
femtokot@gmail.com

Анатолий Арсениев

Полина Селькова

Александра Васильева

Марина Абрамова

Наталия Щеглова

Ирина Французова

Макс Казалов

Изучение роли системы CRISPR-Cas в физиологии бактерии Clostridioides difficile

Описание исследований

Clostridioides difficile (синоним Clostridium difficile) – это анаэробная, грамположительная, спорообразующая бактерия, которая является одной из самых распространенных патогенных клостридий. C. difficile вызывает внутрибольничные кишечные инфекции, связанные с применением антибиотиков. В последнее время число серьёзных инфекций, вызванных C. difficile, значительно возросло в связи с появлением гипервирулентных эпидемических штаммов и штаммов, устойчивых к действию антибиотиков. Поэтому сейчас особенно важен поиск новых подходов для лечения таких кишечных инфекционных заболеваний.

Во время своего инфекционного цикла C. difficile взаимодействует с бактериофагами и другими мобильными генетическими элементами в кишечнике организма-хозяина, используя специальные системы контроля генетического обмена, среди которых недавно обнаруженная активная система СRISPR-Cas. СRISPR-Cas – это системы адаптивного иммунитета бактерий и архей, которые защищают их клетки от инфекции бактериофагов и проникновения других генетических паразитов. СRISPR-Cas система у C. difficile характеризуется нестандартными свойствами, которые не встречаются у других бактерий. Данная система у C. difficile состоит из множественных активно экспрессирующихся CRISPR-кассет, часть из которых находится в профагах, нескольких наборов cas генов подтипа I-B, а также систем токсин-антитоксин I типа, ассоциированных с некоторыми кассетами. Такая сложно устроенная система может играть роль в вирулентности, устойчивости к стрессам, антибиотикам, и в других особенностях физиологии C. difficile. Поэтому ее СRISPR-Cas система может быть использована как основа при разработке новых лекарств.

Наша группа изучает особенности функционирования и регуляции системы CRISPR-Cas у лабораторных штаммов C. difficile. Мы изучаем механизмы действия данной системы при защите клеток C. difficile от генетических паразитов. Также мы исследуем регуляцию CRISPR-Cas в различных условиях роста C. difficile и ищем возможные дополнительные функции данной системы в физиологии этой бактерии.

Основные публикации:

  1. Maikova A.*, Peltier J.*, Boudry P., Hajnsdorf E., Kint N., Monot M., Poquet I., Martin-Verstraete I., Dupuy B. and Soutourina O. Discovery of new type I toxin–antitoxin systems adjacent to CRISPR arrays in Clostridium difficile. Nucleic Acids Res. 2018; 46(9):4733-4751. DOI:10.1093/nar/gky124

  2. Maikova A., Severinov K. and Soutourina O. New insights into functions and possible applications of Clostridium difficile CRISPR-Cas system. Front. Microbiol. 2018; 9:1740. DOI: 10.3389/fmicb.2018.01740

  3. Maikova A., Kreis, V., Boutserin, A., Severinov, K. and Soutourina, O. Using endogenous CRISPR-Cas system for genome editing in the human pathogen Clostridium difficile. Appl. Environ. Microbiol. 2019; 85(20):e01416-19. DOI: 10.1128/AEM.01416-19

  4. Peltier, J., Hamiot, A., Garneau, J.R., Boudry P., Maikova A., Hajnsdorf E., Fortier L.-C., Dupuy B. and Soutourina O. Type I toxin-antitoxin systems contribute to the maintenance of mobile genetic elements in Clostridioides difficile. Commun. Biol. 2020; 3(718). DOI:10.1038/s42003-020-01448-5

Руководитель группы
Анна Майкова, PhD
ann-maikova@yandex.ru




Исследование развития инфекции клеток гигантскими бактериофагами

Описание исследований

Бактериофаги - это вирусы бактерий, представляющие из себя вне бактериальной клетки молекулу нуклеиновой кислоты, упакованной в белковую оболочку. Когда же бактериофаг встречает бактерию, в которой может размножаться, то он переносит внутрь этой бактерии свою наследственную информацию, что запускает программу формирования новых фаговых частиц.

Нашим основным объектом исследования является гигантский бактериофаг phiKZ и родственные ему фаги. За 60 минут, которые проходят с момента впрыска фаговой ДНК phiKZ до выхода новосинтезированных фаговых частиц, кардинально перестраиваютcя все процессы внутри клетки и существенно меняют морфологию бактерии: бактериальный нуклеоид меняет свое положение, уступая центральное место сферическому компартменту, напоминающий ядро эукариотической клетки. Данный компартмент покрыт белковой оболочкой, внутрь которой упаковывается фаговая ДНК и часть белков, участвующих в транскрипции и репликации, кроме того он удерживается в центре клетки за счет тубулин-подобных фаговых белков. Для транскрипции своего генома фаг phiKZ исключительно свои ДНК-зависимые РНК-полимеразы, которых у него две.

Наша группа изучает процессы, происходящие внутри клетки на фоне инфекции фагом phiKZ и механизмы, отвечающие за их осуществление.

Основные публикации:

  1. Danilova Y.A.; Belousova V.V.; Moiseenko A.V.; Vishnyakov I.E.; Yakunina M.V.; Sokolova O.S. Maturation of Pseudo-Nucleus Compartment in P. aeruginosa, Infected with Giant phiKZ Phage, Viruses 2020, 12, 1197

  2. Orekhova, M., Koreshova, A., Artamonova, T., Khodorkovskii, M., Yakunina, M. The study of the phiKZ phage non-canonical non-virion RNA polymerase, Biochemical and Biophysical Research Communications, 2019, doi: 10.1016/j.bbrc.2019.02.132

  3. Lavysh D, Sokolova M, Minakhin L, Yakunina M, Artamonova T, Kozyavkin S, Makarova KS, Koonin EV, Severinov K. The genome of AR9, a giant transducing Bacillus phage encoding two multisubunit RNA polymerases, Journal of Virology – 2016. – Vol. 495. – P. 185-196.

  4. Yakunina M, Artamonova T, Borukhov S, Kira S. Makarova, Severinov K, Minakhin, L. A non-canonical multisubunit RNA polymerase encoded by a giant bacteriophage, Nucleic Acids Research. - 2015. - Vol. 43. – P. 10411-10420.

Руководитель группы
Мария Якунина, к.б.н.
yakuninam@gmail.com

Мария Орехова

Инна Курдюмова

Дарья Антонова

Анна Литвинова

Андрей Усатых

Анна Нечепаренко

Анастасия Зотова

Изучение молекулярных механизмов систем рестрикции-модификации и других защитных систем бактерий от вирусов на уровне одиночных бактериальных клеток

Описание исследований

В живой природе бактерии постоянно подвергаются заражению вирусами, которых называют бактериофагами. Такие вирусы способны чрезвычайно эффективно уничтожать целые бактериальные популяции. Для своей защиты от вирусной инфекции бактерии выработали множество молекулярных механизмов, действующих на совершенно разные части бактериофага на разных стадиях его развития в клетке.

Одними из самых распространённых защитных систем бактерий являются системы рестрикции-модификации. Такие системы действуют за счёт активности эндонуклеазы рестрикции, которая вносит двунитевой разрыв в специфические сайты узнавания на ДНК и метилтрансферазной активности, которая метилирует геном бактерии, защищая его от деградации эндонуклеазой рестрикции. Несмотря на высокий уровень защиты, обеспечиваемый этими системами, в некоторых случаях ДНК инфицирующего бактериофага избегает деградации и подвергается модификации. В результате возникает модифицированное вирусное потомство, полностью устойчивое к действию системы рестрикции-модификации.

Мы изучаем влияние вариации экспрессии генов систем рестрикции-модификации на эффективность защиты одиночных бактерий от вируса. Также мы занимаемся изучением механизмов работы других систем защиты бактерий от вируса на уровне одиночных бактерий.

Основные публикации:

  1. Morozova N, Sabantsev A, Bogdanova E, Fedorova Y, Maikova A, Vedyaykin A, et al. Temporal dynamics of methyltransferase and restriction endonuclease accumulation in individual cells after introducing a restriction-modification system. Nucleic Acids Research, 2016, 44(2), 790-800. DOI: 10.1093/nar/gkv1490.

  2. A. Strotskaya, E. Savitskaya, A. Metlitskaya, N. Morozova, K. Datsenko, E. Semenova, K. Severinov. The action of Escherichia coli CRISPR–Cas system on lytic bacteriophages with different lifestyles and development strategies. Nucleic Acids Research, 2017, 45(4), 1946-1957. DOI: 10.1093/nar/gkx042.

  3. B. Wilcox, I. Osterman, M. Serebryakova, D. Lukyanov, E. Komarova, B. Gollan, N. Morozova, Yu. Wolf, K. Makarova, S. Helaine, P. Sergiev, S. Dubiley, S. Borukhov, K. Severinov. Escherichia coli ItaT is a type II toxin that inhibits translation by acetylating isoleucyl-tRNAIle. Nucleic Acids Research, 2018, 46(15), 7873–7885. DOI: 10.1093/nar/gky560.

  4. Smirnov, S.V., Morozova, N.E., Khodorkovskii, M.A., Severinov, K.V. Fluorescence microscopy study of the effect of Esp1396I restriction-modification system proteins concentrations on protection against lambda phage. Journal of Physics: Conference Series, 2018, 1135(1), 012016. DOI: 10.1088/1742-6596/1135/1/012016.

  5. J. Gordeeva, N. Morozova, N. Sierro, A. Isaev, T. Sinkunas, K. Tsvetkova, M. Matlashov, L. Truncaitė, R.D. Morgan, N.V. Ivanov, V. Siksnys, L. Zeng, K. Severinov. BREX system of Escherichia coli distinguishes self from non-self by methylation of a specific DNA site. Nucleic Acids Research, 2019, 47(1), 253–265. DOI: doi.org/10.1093/nar/gky1125.

  6. Antonova, D.A., Morozova, N.E., Shiryaeva, A.A., Khodorkovskii, M.A. Regulation of type II restriction-modification system Esp1396I. Journal of Physics: Conference Series, 2019, 1400(3), 033024. DOI: 10.1088/1742-6596/1400/3/033024.

  7. Znobishcheva, E.A., Morozova, N.E., Khodorkovskii, M.A. Fluorescent labeling of bacteriophage T7 by CRISPR-Cas9. Journal of Physics: Conference Series, 2019; 1400(3), 033005. DOI: 10.1088/1742-6596/1400/3/033005.

Руководитель группы
Наталия Морозова, к.б.н.
natusmorozovna@gmail.com

Александр Кириллов

Елена Знобищева

Оксана Котовская

Изучение механизмов деления бактерий

Описание исследований

Цитоскелет – это белковый «каркас» клетки. Долгое время белки цитоскелета считались принадлежностью лишь эукариотических клеток – действительно, зачем бактериям цитоскелет, если они покрыты жесткой клеточной стенкой? Тем не менее, за последние 30 лет у бактерий были обнаружены гомологи всех основных белков цитоскелета эукариот – актина, тубулина и промежуточных филаментов. Эти белки в бактериях принимают участие в различных жизненно важных процессах, в том числе в поддержании формы клетки, сегрегации молекул ДНК, клеточном делении. Одним из важнейших белков бактериального цитоскелета является FtsZ – ключевой белок деления, являющийся гомологом тубулина.

Как именно белок FtsZ участвует в делении бактерий? Многое об этом ещё неизвестно, однако в хорошо изученных видах бактерий, например, в Escherichia coli, роль белка FtsZ в целом ясна. FtsZ в клетке полимеризуется и формирует Z-кольцо, которое является каркасом, своеобразными «строительными лесами» для других белков деления. Именно эти белки, как считается, выполняют основную работу по строительству перегородки между будущими дочерними клетками и некоторые другие функции, а FtsZ лишь направляет эти белки, обеспечивая их слаженную работу. Однако не следует полагать, что о делении бактерий уже всё известно. Какова точная структура Z-кольца? Деформируют ли полимеры FtsZ оболочку клетки? Как делятся бактерии, у которых нет белка FtsZ? На эти и многие другие вопросы ещё предстоит найти ответы.

Наша группа занимается изучением свойств белка FtsZ: мы визуализируем структуры, которые формирует этот белок в бактериальных клетках и в пробирке; определяем, с какими белками он взаимодействует; выясняем, чем отличаются роли и функции белка FtsZ в разных видах бактерий. Кроме того, мы имеем цель выяснить, как делятся бактерии, которые не имеют белка FtsZ. Наконец, нам интересны белки бактерий, которые формируют цитоскелет-подобные структуры.

Основные публикации:

  1. Vedyaykin, A.D., I.E. Vishnyakov, V.S. Polinovskaya, M.A. Khodorkovskii, and A.V. Sabantsev, New insights into FtsZ rearrangements during the cell division of Escherichia coli from single-molecule localization microscopy of fixed cells, Microbiologyopen, 2016, 5(3): 378-386.

  2. Vedyaykin, A.D., A.V. Sabantsev, M.A. Khodorkovskii, A.R. Kayumov, and I.E. Vishnyakov, Recombinant FtsZ Proteins from Mollicutes Interact with Escherichia coli Division Machinery, Bionanoscience, 2016, 6(4): 443-446.

  3. I.E.Vishnyakov, A.D. Vedyaykin, M.A. Khodorkovskii, S.N. Borchsenius, The identification of a protein involved in formation of cytoskeleton-like structures in Mycoplasma gallisepticum cells, 2017, FEBS JOURNAL, 284, 203-203.

  4. A.D. Vedyaykin, E.V. Ponomareva, M.A. Khodorkovskii, S.N. Borchsenius, I.E. Vishnyakov, Mechanisms of Bacterial Cell Division, Microbiology, 2019, 88 (3), 245-260.

  5. A.D. Vedyaykin, A.V. Sabantsev, I.E. Vishnyakov, N.E. Morozova, M.A. Khodorkovskii, Recovery of division process in bacterial cells after induction of SulA protein which is responsible for cytokinesis arrest during SOS-response, Cell and Tissue Biology, 2017, 11 (2), 89-94.

  6. A.D. Vedyaykin, V.S. Polinovskaya, A.V. Sabantsev, M.A. Khodorkovskii, S.N. Borchsenius, I.E. Vishnyakov, Influence of FtsZ proteins from some mycoplasma species on the division process in Escherichia coli cells, Cell and Tissue Biology, 2017, 11 (5), 389-398.

  7. A.D. Vedyaykin, N.A. Rumyantseva, M.A. Khodorkovskii, I.E. Vishnyakov, SulA is able to block cell division in Escherichia coli by a mechanism different from sequestration, Biochemical and Biophysical Research Communications, 2020, Volume 525, Issue 4, 14 May 2020, Pages 948-953.

Руководитель группы
Алексей Ведяйкин, к.б.н.
misterkotlin@gmail.com

Иннокентий Вишняков, к.б.н.

Елена Пономарева

Наталья Румянцева

Анна Шабалина

Яна Егорова

Дарья Голофеева


Кинетика сверхбыстрых процессов в молекулах и кластерах

Описание исследований

Для исследования быстро протекающих процессов используются импульсы света фемтосекундной длительности. Такие импульсы создаются с помощью фемтосекундного лазера на титан-сапфире. Лазерные импульсы (800нм) преобразуются с помощью генератора гармоник (400 и 266 нм) и генератора белого света (излучение суперконтинуума 400-1000 нм). Измерения проводятся методом «возбуждение-зондирование» с помощью линии оптической задержки. Первый импульс приводит к возбуждению объекта, второй импульс приходит к объекту с задержкой и используется для анализа состояния в котором находится объект. Изменяя задержку можно получить информацию о процессах происходящих в исследуемом объекте.

В нашей группе проводятся исследования быстропротекающих процессов в люминесцентных зондах и кластерах инертных газов. Отметим, что при использовании лазерных фемтосекундных импульсов легко наблюдаются различные нелинейные оптические процессы, в частности многофотонное поглощение.

Люминесцентные зонды широко используются для измерения различных параметров (температура, концентрация кислорода, pH) в биологических исследованиях, медицине, аэрокосмической промышленности и микроэлектронике. Люминесцентный зонд это молекула (или частица) оптические свойства которой сильно зависят от измеряемой величины. Как правило измеряется интенсивность свечения или время жизни возбуждённого состояния.

Одним из способов значительного улучшения свойств люминесцентных зондов является использование их в составе молекулярных диад. Молекулярная диада представляет собой два хромофорных центра, соединённых небольшим ковалентным мостиком. В такого типа молекулярных системах после возбуждения одного хромофорного центра возможен перенос энергии между хромофорами. Использование молекулярных диад, где хромофоры имеют разные функции и обмениваются энергией позволяет варьировать свойства систем в целом (изменить положение полос поглощения и/или эмиссии, увеличить/уменьшить диапазон измерений и.т.д.). Наши исследования направлены на определение механизмов передачи энергии в молекулярных диадах, находящихся в электронно-возбуждённом состоянии.

Кластеры инертных газов являются удобным объектом модельным объектом для изучения процессов релаксации в многоатомных системах. Для целого ряда многоатомных систем, находящихся в электронно-возбуждённом состоянии основным механизмом релаксации являются безызлучательные процессы. Как правило, их скорость значительно превышает скорость радиационного распада. В многоатомных молекулах со сравнительно большими энергиями связи между атомами основным и часто единственным механизмом безызлучательной релаксации является электронно-колебательное взаимодействие. В кластерах (многоатомных молекулах, нанокаплях) со сравнительно небольшими энергиями связи между атомами появляются дополнительные каналы релаксации (десорбция атомов, ионизация, фрагментация). При этом доминирующий канал релаксации зависит не только от энергии связи между атомами, но и от размера объекта и энергии возбуждения. Несмотря на активное изучение данных процессов в кластерах даже качественные механизмы релаксации на сегодняшний день не всегда ясны. В кластерах ксенона нами был обнаружен ICD-подобный процесс. Данный процесс возможен при одновременном возбуждении двух атомов входящих в кластер. Перенос энергии между двумя соседними возбужденными атомами приводит к ионизации кластера. Характерное время ионизации кластера ксенона в этом процессе составляет ~ 5 пс.

Основные публикации:

  1. P.Y. Serdobintsev, A.S. Melnikov, A.A. Pastor, N.A. Timofeev, M.A. Khodorkovskiy, J. Chem. Phys., 2018, V.148, 194301

  2. I. Balmaev, P. Serdobintsev, A. Melnikov, A. Pastor, M. Khodorkovskiy, Journal of Physics: Conference Series 1410 (1), 012135

  3. Kisel K.S., Melnikov A.S., Grachova E.V., Hirva P., Tunik S. P., Koshevoy I.O., Chemistry–A European Journal, 2017, V.23, P.11301-11311

  4. Belyaev A., Kolesnikov I., Melnikov A.S., Gurzhiy V.V., Tunik S.P., Koshevoy I.O., New Journal of Chemistry, 2019, V.43, P.13741-13750

Рис. 1. Люминесценция в водном растворе флуоресцеина при двухфотонном возбуждении 800 нм

Рис. 2. Настройка генератора белого света

Рис. 3 Аппаратная функция, измеренная по эффекту наведённого двулучепреломления. Ширина на половине высоты 98 фс

Рис. 4. Эксперимент "возбуждение-зондирование" в струе спиртового раствора Кумарина

Руководитель группы
Алексей Сергеевич Мельников, к.ф.-м.н.
amelnikov-noc@ya.ru

Павел Юрьевич Сердобинцев, к.ф.-м.н.