Лаборатория молекулярной биологии нуклеотид-связывающих белков
Лаборатория молекулярной биологии нуклеотид-связывающих белков была создана в 2014 году в рамках выполнения работ по соглашению № 14-34-00023 от 11.09.2014 между Российским научным фондом, Санкт-Петербургским государственным политехническим университетом и Ходорковским Михаилом Алексеевичем, руководителем поддержанного проекта «Исследование механизмов и динамики нуклеотид-связывающих белков: от бактерий до человека».
Заведующий лабораторией - Михаил Алексеевич Ходорковский.
Проект «Исследование механизмов и динамики нуклеотид-связывающих белков: от бактерий до человека» направлен на решение одной из актуальных проблем биологии: исследование механизмов и динамики взаимодействия различных белков с ДНК, РНК, АТФ и другими нуклеотидами, как с помощью современных экспериментальных биохимических и биофизических методов (малоуглового рассеяния нейтронов, масс- и КД-спектроскопии, оптического захвата, субдифракционной флуоресцентной микроскопии, спектрофотометрии, спектрофлюоромметрии и др.) так и с помощью теоретических методов молекулярного моделирования и молекулярной динамики. Исследуемые нами белки (RecA, RecX, DinI, FtsZ, TIP49A/B, белки рибосом участвующие в процессе транслокации мРНК) вовлечены во многие важнейшие процессы жизнедеятельности живых клеток про- и эукариот, такие как структурные перестройки хроматина во время репарации ДНК, регуляция транскрипции, поддержание стабильности генома, биогенез белков, формирование и поддержание теломер, делении клеток, трансляции и многих других. Несмотря на свое большое разнообразие белки исследуемого нами набора обладают одним общим свойством – свойством взаимодейстия с ДНК, РНК, АТФ и другими нуклеотидами.
Задачи проекта:
Исследование механизмов и динамики взаимодействия белка RecA E. coli и D. radiodurans с ДНК, а также регуляции этого процесса вспомогательными белками RecX, SSB и DinI биохимическими, оптическими и одномолекулярными биофизическими методами;
Исследование динамики и механизмов регуляции структур, формируемых белком FtsZ в клетках бактерий при помощи генноинженерных методов и субдифракционной микроскопии;
Изучение взаимодействий между компонентами макромолекулярного рибонуклеопротеинового рибосомного комплекса в процессе трансляции с использованием биохимических и одномолекулярных биофизических методов;
Установление связи между структурой и функцией жизненно важных белков семейства TIP49 и исследовании молекулярных механизмов их действия.
Основные исполнители:
Петухов Михаил Геннадьевич
Коневега Андрей Леонидович
Байтин Дмитрий Михайлович
Побегалов Георгий Евгеньевич
Основные результаты проекта:
За время проекта был достигнут значительный прогресс в понимании механизмов работы изучаемых белков, а часть из этих результатов смо-гут конвертироваться в потенциально перспективные терапевтические агенты.
Одной из таких мишеней, по которой получены многообещающие результаты, является белок RecA, центральный фермент рекомбинационной репарации, функционально задействованный в общей резистентно-сти патогенных для человека бактерий.
Многообещающим результатом проекта является разработка и создание пептида-ингибитора активности этого белка, блокирующего SOS-ответ у бактерий. Исследования взаимодействия RecA с другими бактериальными белками и ДНК ингибирующие свойства этого пептида были изучены с помощью широкого набора биохимических методов, методов оптической флюоресцентной микроскопии, оптической спектроскопии поглощения и флюоресценции, спектроскопии кругового дихроизма и одномолекулярных методов с использованием оптической ловушки. Исходя из результатов исследования и модели формирования пептида ингибитора, на основе фрагмента белка RecX в 2016 году была подготовлена и подана заявка на изобретение на семейство пептидов – ингибиторов (около 17 000 соединений) активности белка RecA, блокирующих SOS-ответ у бактерий. Поскольку система бактериального SOS-ответа является основным механизмом адаптации бактерий к антибиотикам, этот результат открывает возможность решения одной из мировых проблем в современной медицине – создания нового поколения антибиотиков, к которым бактерии не смогут вырабатывать резистентность.
Важный результат также получен относительно свойств RecA бактерии Deinococcus radiodurans, проявляющей чрезвычайную эффективность системы репарации, что может быть использовано для создания эффективных биотехнологических штаммов микроорганизмов для обезвреживания радиоактивных отходов и, соответственно, улучшению среды обитания человека. Методом оптического захвата показано, что это свойство обеспечено существенно более быстрым построением филамента RecADr на двунитевой ДНК по сравнению с RecAEc.
Еще одной важной мишенью является белок TIP49. В рамках проекта проведено всесторонне исследование этого белка, используя биохимиче-ские и одномолекулярные методы, и методы молекулярного моделирования и молекулярной динамики.
Для выполнения этих исследований была разработана специализированная обновленная и ускоренная версия алгоритма SEQOPT предназначенного для глобальной оптимизации аминокислотных последовательностей альфа-спиралей белков. С помощью этой версии была восстановлена полноатомная модель смешанного додекамерного комплекса TIP49a/b и проанализированы интерфейсы додекамеризации. Был также разработан AquaBridge новый метод поиска всех возможных конформаций тесно-связанной (структурной) воды в АЦ репрезентативного набора АТФаз для использования в коммерчески доступном программном пакете моле-кулярного моделирования ICM-Pro. С помощью этого метода получены новые данные об ориентации литической воды в атакующей позиции, необходимой для протекания гидролиза АТФ в белковых комплексах TIP49.
Предложен новый молекулярный механизм аллостерического влияния ДНК на АТФазную активность TIP49 и получен первый практически важный результат. В совместной работе с нашими коллегами из Гарвардского университета (США) и Университета Поля Сабатье (Франция) бы-ли разработаны и экспериментально протестированы несколько новых низкомолекулярных ингибиторов белков семейства TIP49, обладающих антираковой активностью на нескольких раковых клеточных линиях. Продолжение этой работы позволит не только разработать новые эффективные методы конструирования высокоэффективных лигандов белков, но и создать новые лекарственные средства для онкологических заболеваний.
Другой перспективной мишенью для новых антибактериальных препаратов является белок FtsZ, ключевой элемент аппарата деления прокариот. За период выполнения проекта нам удалось значительно продвинуться в понимании механизмов функционирования и регуляции этого важного элемента бактериальной клетки. Так, использование флуоресцентной микроскопии сверхвысокого разрешения позволило разрешить Z-кольцо – центральную структуру, формируемую белком FtsZ – с недостижимым прежде разрешением (около 20 нм), в результате был сделан вывод о меньшей толщине Z-кольца, чем считалось прежде. Более того, впервые было показано, что Z-кольцо утолщается в процессе сокращения.
Наряду с изучением структур FtsZ в нормально делящихся бактериях, в данной работе исследовалось влияние на FtsZ факторов, блокирующих деление бактериальной клетки, например, состояния SOS-ответа. Как отмечено выше, SOS-ответ является одним из главных механизмов формирования устойчивости бактерий к антибиотикам. Как активация SOS-ответа, так и выживание клеток после него сопряжены с регуляцией FtsZ: при активации SOS-ответа происходит блокирование FtsZ, по окончании данного состояния FtsZ восстанавливает свою активность, которая критически необходима для выживания клетки. Таким образом, создание ингибиторов FtsZ позволит блокировать как само состояние SOS-ответа, так и процесс выхода из него. В ходе выполнения проекта нам удалось получить важные сведения о механизмах, отвечающих за блокирование FtsZ при наступлении SOS-ответа, а также обеспечивающих правильное позиционирование Z-колец при восстановлении деления. Однако для лучшего понимания о месте и роли FtsZ в данном состоянии требуются дальнейшие исследования.
Кроме изучения механизмов работы белка FtsZ E.coli, в настоящем проекте был дан старт исследованиям FtsZ некоторых видов микоплазм, серьёзных патогенов человека, животных и растений, о механизмах деления которых пока практически ничего неизвестно. Предварительные данные об активности этих белков выглядят многообещающими, продолжение этого направления исследований может привести к прорыву в данной области знаний. В целом стоит отметить, что новые данные о механизмах деления бактерий, в особенности о белке FtsZ, полученные в ходе выполнения проекта, позволяют лучше понять динамические процессы, происходящие в ходе деления бактерий, и должны помочь в создании новых препаратов, на-прямую блокирующих ключевой белок FtsZ. Дальнейшие работы должны помочь существенно продвинуться в этом направлении.
Были разработаны методики получения отдельных компонентов трансляционной системы из термофильных бактерий Thermus thermophilus. Поставлены и оптимизированы методики, позволяющие собирать как гомогенные, так и гетерогенные системы для изучения отдельных реакций цикла элонгации in vitro, состоящие из термофильных (T. thermophilus) и мезофильных (E. coli) компонентов трансляционной ма-шины. Были разработаны методики, позволяющие сайт-специфично вводить одну или две флуоресцентные метки в молекулы нативных тРНК и транскриптов тРНК, модифицированных по определенным положениям.
Впервые в мире с использованием флуоресцентных меток при помощи спектрофлуориметра остановленного потока были получены данные о престационарной кинетике отдельных реакций цикла элонгации (А-сайтовое взаимодействие аминоацил-тРНК с рибосомами, транслокация, катализируемая элонгационным фактором EF-G, взаимодействие деацилированной тРНК с выходным (Е) сайтом 70S рибосом) с использованием компонентов термофильной системы (рибосомы, EF-Tu, EF-G). Для отдельных реакций были проанализированы концентрационные и температурные зависимости, а также оценено влияние ряда антибиотиков. В частности, добавление антибиотика тетрациклина приводило к кинетическому ингибированию реакции связывания в А сайте, а среди характерных механизмов ингибирования транслокации следует отметить рассинхронизацию движения тРНК (физического перемещения акцепторного конца и угла L-образной структуры тРНК). Дополнительно было показано, что виомицин и паромомицин модифицируют термодинамический профиль реакции транслокации на рибосоме и смещают равновесие в сторону претранслокационного состояния при отсутствии элонгационного фактора EF-G и гидролиза GTP.
Для измерения силы взаимодействия мРНК-рибосома использовались одномолекулярные методы на основе оптической ловушки и акустической cиловой спектроскопии. Измеренная сила, необходимая для разрыва взаимодействия мРНК-рибосома составила 14pN для рибосомного комплекса, содержащего инициаторную fMet-тРНКfMet в Р сайте.
Была определена специфичность бактериальной дигидроуридинсинтазы DusC и построены полноатомные модели комплексов белка DusC с триптофановой тРНК. Методами молекулярного моделирования были найдены разные конформации, при которых уридины в определенных положениях оказывались в активном центре белка DusC, и при этом имелось достаточное количество контактов для образования комплекса. При помощи моделирования молекулярной динамики были построены траекто-рии для ряда комплексов и произведена оценка их стабильности.
Патенты:
Байтин Д.М., Бахланова И.В., Петухов М.Г., Побегалов Г.Е., Ходорковский М.А., Якимов А.П., Семейство пептидов - ингибиторов активностей белка RecA, блокирующих SOS-ответ у бактерий, уведомление о поступлении заявки о выдаче патента РФ № 2016127595 от 08.07.2016
Публикации: список публикаций представлен в общем разделе.