Научные группы
Изучение CRISPR-Cas систем и применение их в биотехнологии
Описание исследований
CRISPR-Cas - защитные системы бактерий и архей, которые помогают им справляться с натиском бактериофагов и других мобильных генетических элементов. Работа этих систем основана на действии Cas нуклеаз - белков, в комплексе с направляющими РНК способными распознать геном бактериофага и внести в него разрыв. Это приводит к деградации генома вируса и прекращению распространения инфекции в бактериальной популяции.
Оказалось, что используя направляющие РНК конкретной последовательности можно направлять Cas нуклеазы на любые участки генома, как бактерий, так и эукариот (растений, животных и даже человека) и вносить в ДНК специфические разрывы. Такой подход можно использовать для генетической инженерии - направленного изменения генома для придания желаемых свойств организму.
CRISPR-Cas системы очень разные, их эволюция прошла долгий и уникальный путь.
Наша группа занимается изучением многообразия CRISPR-Cas систем и поиска новых способов их применения в биотехнологии.
Основные публикации:
Fedorova, I.*; Arseniev, A.*; Selkova, P.; Pobegalov, G.; Goryanin, I.; Vasileva, A.; Musharova, O.; Abramova, M.; Kazalov, M.; Zyubko, T.; Artamonova, T.; Artamonova, D.; Shmakov, S.; Khodorkovskii, M.; Severinov, K. DNA Targeting by Clostridium Cellulolyticum CRISPR-Cas9 Type II-C System. Nucleic Acids Research, 2020, 48(4), 2026–2034. DOI: 10.1093/nar/gkz1225.
Selkova,P.*; Vasileva,A.*; Pobegalov, G.; Musharova, O.; Arseniev, A.; Kazalov, M.; Zyubko, T.; Shcheglova, N.; Artamonova, T.; Khodorkovskii, M.; Severinov, K. and Fedorova, I. Position of Deltaproteobacteria Cas12e nuclease cleavage sites depends on spacer length of guide RNA. RNA biology, 2020. DOI: 10.1080/15476286.2020.1777378.
Fedorova I.*, Vasileva A.*, Selkova P., Abramova M., Arseniev A., Pobegalov G., Kazalov M., Musharova O., Goryanin I., Artamonova D., Zyubko T., Shmakov S., Artamonova T., Khodorkovskii M., Severinov K, PpCas9 from Pasteurella pneumotropica- A compact Type II-C Cas9 ortholog active in human cells, Nucleic Acids Research, 2021, V. 48, Is. 21, pp. 12297-123092
Vasileva A, Selkova P, Arseniev A, Abramova M, Shcheglova N, Musharova O, Mizgirev I, Artamonova T, Khodorkovskii M, Severinov K, Fedorova I. Characterization of CoCas9 nuclease from Capnocytophaga ochracea, RNA Biology, 2023, 20(1): 750-759, doi: 10.1080/15476286.2023.2256578
Руководитель группы
(In vitro / single molecule характеризация CRISPR-Cas)
Анатолий Арсениев
arsenievanatoly@gmail.com
Руководитель группы
(биоинформатический поиск и характеризация новых CRISPR- Cas)
Александра Васильева
daucussativus7@gmail.com
Марина Абрамова
Яна Гатиева
Наталия Щеглова
Полина Малышева
Александра Горьковская
Даниил Кретов
Исследование развития инфекции клеток гигантскими бактериофагами
Описание исследований
Бактериофаги - это вирусы бактерий, представляющие из себя вне бактериальной клетки молекулу нуклеиновой кислоты, упакованной в белковую оболочку. Когда же бактериофаг встречает бактерию, в которой может размножаться, то он переносит внутрь этой бактерии свою наследственную информацию, что запускает программу формирования новых фаговых частиц.
Нашим основным объектом исследования является гигантский бактериофаг phiKZ и родственные ему фаги. За 60 минут, которые проходят с момента впрыска фаговой ДНК phiKZ до выхода новосинтезированных фаговых частиц, кардинально перестраиваютcя все процессы внутри клетки и существенно меняют морфологию бактерии: бактериальный нуклеоид меняет свое положение, уступая центральное место сферическому компартменту, напоминающий ядро эукариотической клетки. Данный компартмент покрыт белковой оболочкой, внутрь которой упаковывается фаговая ДНК и часть белков, участвующих в транскрипции и репликации, кроме того он удерживается в центре клетки за счет тубулин-подобных фаговых белков. Для транскрипции своего генома фаг phiKZ исключительно свои ДНК-зависимые РНК-полимеразы, которых у него две.
Наша группа изучает процессы, происходящие внутри клетки на фоне инфекции фагом phiKZ и механизмы, отвечающие за их осуществление.
Основные публикации:
Danilova Y.A.; Belousova V.V.; Moiseenko A.V.; Vishnyakov I.E.; Yakunina M.V.; Sokolova O.S. Maturation of Pseudo-Nucleus Compartment in P. aeruginosa, Infected with Giant phiKZ Phage, Viruses 2020, 12, 1197
Orekhova, M., Koreshova, A., Artamonova, T., Khodorkovskii, M., Yakunina, M. The study of the phiKZ phage non-canonical non-virion RNA polymerase, Biochemical and Biophysical Research Communications, 2019, doi: 10.1016/j.bbrc.2019.02.132
Lavysh D, Sokolova M, Minakhin L, Yakunina M, Artamonova T, Kozyavkin S, Makarova KS, Koonin EV, Severinov K. The genome of AR9, a giant transducing Bacillus phage encoding two multisubunit RNA polymerases, Journal of Virology – 2016. – Vol. 495. – P. 185-196.
Yakunina M, Artamonova T, Borukhov S, Kira S. Makarova, Severinov K, Minakhin, L. A non-canonical multisubunit RNA polymerase encoded by a giant bacteriophage, Nucleic Acids Research. - 2015. - Vol. 43. – P. 10411-10420.
Natàlia de Martín Garrido, Orekhova M., Yuen Ting Emilie Lai Wan Loong, Anna Litvinova, Kailash Ramlaul, Tatyana Artamonova, Alexei S Melnikov, Pavel Serdobintsev, Christopher H S Aylett, Maria Yakunina. Structure of the bacteriophage PhiKZ non-virion RNA polymerase, Nucleic Acids Research, 2021, Volume 49, Volume 49, Issue 13, P. 7732–7739, doi: 10.1093/nar/gkab539
Руководитель группы
Мария Якунина, к.б.н.
yakuninam@gmail.com
Инна Курдюмова
Дарья Антонова
Анна Ничипоренко
Одномолекулярные исследования ДНК-белковых взаимодействий
Описание исследований
Группа фокусируется на исследованиях ДНК-белковых взаимодействий при помощи метода оптического захвата, реализованного на установке Лазерный пинцет. Комбинация метода оптического захвата с микрофлюидной системой ламинарных потоков позволяет отслеживать изменения механических свойств индивидуальных молекул ДНК в ходе взаимодействия с ДНК-связывающими белками. При помощи метода оптического захвата наша группа изучает свойства нуклеопротеиновых комплексов, формируемых бактериальным белком RecA (E. coli, D. radiodurans) на дуплексной и однонитевой (одноцепочечной) молекулах ДНК. В бактериях RecA в виде нуклеопротеинового филамента, формируемого на однонитевой ДНК, участвует сразу в нескольких ключевых процессах: репарации тяжелых повреждений ДНК, передаче генов устойчивости к антибиотикам, запуске SOS-ответа. Считается известным, что в зависимости от типа связанного нуклеотидного кофактора филамент RecA на однонитевой ДНК может находиться в активной или неактивной конформации. Для поддержания активной конформации филамента необходимо наличие в среде свободной АТФ. АТФазная активность RecA потенциально приводит к локальному возникновению участков неактивной конформации в структуре филамента, в целом обладающего активной конформацией. Нашей группой проводятся исследования конформационных перестроек и состояний филамента RecA а также регуляции активности RecA белковыми кофакторами.
Группа также занимается исследованиями бактериальной транскрипции и её регуляции на уровне одиночных молекул в режиме реального времени, применяя метод акустической силовой спектроскопии. Мы являемся первыми в мире, кто успешно применил этот одномолекулярный подход для изучения процессов транскрипции. Разработанная методика позволила выявить характер ингибирования новых лассо-пептидов ацинетодина и клебсидина. На данный момент мы подготавливаем публикацию, в которой представлен уникальный способ синергетического ингибирования РНК-полимеразы антибиотиком стрептолидигином совместно с транскрипционными факторами GreA и GreB. Наши исследования в этой области не только расширяют понимание молекулярных механизмов бактериальной транскрипции, но также могут иметь важные практические применения в разработке новых антимикробных препаратов
Основные публикации:
Alekseev, A., Serdakov, M., Pobegalov, G., Yakimov, A., Bakhlanova, I., Baitin, D., Khodorkovskii, M. Single‐molecule analysis reveals two distinct states of the compressed RecA filament on single‐stranded DNA. FEBS letters, 2020, 594(21), 3464-3476.
Alekseev, A., Cherevatenko, G., Serdakov, M., Pobegalov, G., Yakimov, A., Bakhlanova, I., Baitin, D., Khodorkovskii, M. Single-Molecule Insights into ATP-Dependent Conformational Dynamics of Nucleoprotein Filaments of Deinococcus radiodurans RecA. International journal of molecular sciences, 2020, 21(19), 7389.
Yakimov, A., Pobegalov, G., Bakhlanova, I., Khodorkovskii, M., Petukhov, M., Baitin, D. Blocking the RecA activity and SOS-response in bacteria with a short α-helical peptide. Nucleic acids research, 2017, 45(16), 9788-9796.
Pobegalov, G, Cherevatenko, G., Alekseev, A., Sabantsev, A., Kovaleva, O., Vedyaykin, A., Morozova, N., Baitin, D., Khodorkovskii, M. Deinococcus radiodurans RecA nucleoprotein filaments characterized at the single-molecule level with optical tweezers. Biochemical and biophysical research communications, 2015, 466(3), 426-430.
Metelev M, Arseniev A, Bushin LB, Kuznedelov K, Artamonova TO, Kondratenko R, Khodorkovskii M, Seyedsayamdost MR, Severinov K. Acinetodin and Klebsidin, RNA Polymerase Targeting Lasso Peptides Produced by Human Isolates of Acinetobacter gyllenbergii and Klebsiella pneumoniae. ACS Chem Biol. 2017 Mar 17;12(3):814-824
Руководитель группы
Анатолий Арсениев
arsenievanatoly@gmail.com
Руководитель группы
Александр Алексеев
alex35093@gmail.com
Изучение молекулярных механизмов систем рестрикции-модификации и других защитных систем бактерий от вирусов на уровне одиночных бактериальных клеток
Описание исследований
В живой природе бактерии постоянно подвергаются заражению вирусами, которых называют бактериофагами. Такие вирусы способны чрезвычайно эффективно уничтожать целые бактериальные популяции. Для своей защиты от вирусной инфекции бактерии выработали множество молекулярных механизмов, действующих на совершенно разные части бактериофага на разных стадиях его развития в клетке.
Одними из самых распространённых защитных систем бактерий являются системы рестрикции-модификации. Такие системы действуют за счёт активности эндонуклеазы рестрикции, которая вносит двунитевой разрыв в специфические сайты узнавания на ДНК и метилтрансферазной активности, которая метилирует геном бактерии, защищая его от деградации эндонуклеазой рестрикции. Несмотря на высокий уровень защиты, обеспечиваемый этими системами, в некоторых случаях ДНК инфицирующего бактериофага избегает деградации и подвергается модификации. В результате возникает модифицированное вирусное потомство, полностью устойчивое к действию системы рестрикции-модификации.
Мы изучаем влияние вариации экспрессии генов систем рестрикции-модификации на эффективность защиты одиночных бактерий от вируса. Также мы занимаемся изучением механизмов работы других систем защиты бактерий от вируса на уровне одиночных бактерий.
Основные публикации:
Morozova N, Sabantsev A, Bogdanova E, Fedorova Y, Maikova A, Vedyaykin A, et al. Temporal dynamics of methyltransferase and restriction endonuclease accumulation in individual cells after introducing a restriction-modification system. Nucleic Acids Research, 2016, 44(2), 790-800. DOI: 10.1093/nar/gkv1490.
A. Strotskaya, E. Savitskaya, A. Metlitskaya, N. Morozova, K. Datsenko, E. Semenova, K. Severinov. The action of Escherichia coli CRISPR–Cas system on lytic bacteriophages with different lifestyles and development strategies. Nucleic Acids Research, 2017, 45(4), 1946-1957. DOI: 10.1093/nar/gkx042.
B. Wilcox, I. Osterman, M. Serebryakova, D. Lukyanov, E. Komarova, B. Gollan, N. Morozova, Yu. Wolf, K. Makarova, S. Helaine, P. Sergiev, S. Dubiley, S. Borukhov, K. Severinov. Escherichia coli ItaT is a type II toxin that inhibits translation by acetylating isoleucyl-tRNAIle. Nucleic Acids Research, 2018, 46(15), 7873–7885. DOI: 10.1093/nar/gky560.
Smirnov, S.V., Morozova, N.E., Khodorkovskii, M.A., Severinov, K.V. Fluorescence microscopy study of the effect of Esp1396I restriction-modification system proteins concentrations on protection against lambda phage. Journal of Physics: Conference Series, 2018, 1135(1), 012016. DOI: 10.1088/1742-6596/1135/1/012016.
J. Gordeeva, N. Morozova, N. Sierro, A. Isaev, T. Sinkunas, K. Tsvetkova, M. Matlashov, L. Truncaitė, R.D. Morgan, N.V. Ivanov, V. Siksnys, L. Zeng, K. Severinov. BREX system of Escherichia coli distinguishes self from non-self by methylation of a specific DNA site. Nucleic Acids Research, 2019, 47(1), 253–265. DOI: doi.org/10.1093/nar/gky1125.
Antonova, D.A., Morozova, N.E., Shiryaeva, A.A., Khodorkovskii, M.A. Regulation of type II restriction-modification system Esp1396I. Journal of Physics: Conference Series, 2019, 1400(3), 033024. DOI: 10.1088/1742-6596/1400/3/033024.
Znobishcheva, E.A., Morozova, N.E., Khodorkovskii, M.A. Fluorescent labeling of bacteriophage T7 by CRISPR-Cas9. Journal of Physics: Conference Series, 2019; 1400(3), 033005. DOI: 10.1088/1742-6596/1400/3/033005.
Руководитель группы
Наталия Морозова, к.б.н.
natusmorozovna@gmail.com
Виктория Рощектаева
Артём Причепа
Любовь Малинникова
Изучение механизмов деления бактерий
Описание исследований
Цитоскелет – это белковый «каркас» клетки. Долгое время белки цитоскелета считались принадлежностью лишь эукариотических клеток – действительно, зачем бактериям цитоскелет, если они покрыты жесткой клеточной стенкой? Тем не менее, за последние 30 лет у бактерий были обнаружены гомологи всех основных белков цитоскелета эукариот – актина, тубулина и промежуточных филаментов. Эти белки в бактериях принимают участие в различных жизненно важных процессах, в том числе в поддержании формы клетки, сегрегации молекул ДНК, клеточном делении. Одним из важнейших белков бактериального цитоскелета является FtsZ – ключевой белок деления, являющийся гомологом тубулина.
Как именно белок FtsZ участвует в делении бактерий? Многое об этом ещё неизвестно, однако в хорошо изученных видах бактерий, например, в Escherichia coli, роль белка FtsZ в целом ясна. FtsZ в клетке полимеризуется и формирует Z-кольцо, которое является каркасом, своеобразными «строительными лесами» для других белков деления. Именно эти белки, как считается, выполняют основную работу по строительству перегородки между будущими дочерними клетками и некоторые другие функции, а FtsZ лишь направляет эти белки, обеспечивая их слаженную работу. Однако не следует полагать, что о делении бактерий уже всё известно. Какова точная структура Z-кольца? Деформируют ли полимеры FtsZ оболочку клетки? Как делятся бактерии, у которых нет белка FtsZ? На эти и многие другие вопросы ещё предстоит найти ответы.
Наша группа занимается изучением свойств белка FtsZ: мы визуализируем структуры, которые формирует этот белок в бактериальных клетках и в пробирке; определяем, с какими белками он взаимодействует; выясняем, чем отличаются роли и функции белка FtsZ в разных видах бактерий. Кроме того, мы имеем цель выяснить, как делятся бактерии, которые не имеют белка FtsZ. Наконец, нам интересны белки бактерий, которые формируют цитоскелет-подобные структуры.
Основные публикации:
Vedyaykin, A.D., I.E. Vishnyakov, V.S. Polinovskaya, M.A. Khodorkovskii, and A.V. Sabantsev, New insights into FtsZ rearrangements during the cell division of Escherichia coli from single-molecule localization microscopy of fixed cells, Microbiologyopen, 2016, 5(3): 378-386.
Vedyaykin, A.D., A.V. Sabantsev, M.A. Khodorkovskii, A.R. Kayumov, and I.E. Vishnyakov, Recombinant FtsZ Proteins from Mollicutes Interact with Escherichia coli Division Machinery, Bionanoscience, 2016, 6(4): 443-446.
I.E.Vishnyakov, A.D. Vedyaykin, M.A. Khodorkovskii, S.N. Borchsenius, The identification of a protein involved in formation of cytoskeleton-like structures in Mycoplasma gallisepticum cells, 2017, FEBS JOURNAL, 284, 203-203.
A.D. Vedyaykin, E.V. Ponomareva, M.A. Khodorkovskii, S.N. Borchsenius, I.E. Vishnyakov, Mechanisms of Bacterial Cell Division, Microbiology, 2019, 88 (3), 245-260.
A.D. Vedyaykin, A.V. Sabantsev, I.E. Vishnyakov, N.E. Morozova, M.A. Khodorkovskii, Recovery of division process in bacterial cells after induction of SulA protein which is responsible for cytokinesis arrest during SOS-response, Cell and Tissue Biology, 2017, 11 (2), 89-94.
A.D. Vedyaykin, V.S. Polinovskaya, A.V. Sabantsev, M.A. Khodorkovskii, S.N. Borchsenius, I.E. Vishnyakov, Influence of FtsZ proteins from some mycoplasma species on the division process in Escherichia coli cells, Cell and Tissue Biology, 2017, 11 (5), 389-398.
A.D. Vedyaykin, N.A. Rumyantseva, M.A. Khodorkovskii, I.E. Vishnyakov, SulA is able to block cell division in Escherichia coli by a mechanism different from sequestration, Biochemical and Biophysical Research Communications, 2020, Volume 525, Issue 4, 14 May 2020, Pages 948-953.
Руководитель группы
Алексей Ведяйкин, к.б.н.
misterkotlin@gmail.com
Иннокентий Вишняков, к.б.н.
Дарья Голофеева
Наталья Румянцева
Айзиля Хасанова
Мария Кудрявцева
Кирилл Нагорный
Антонина Сапожникова
Владимир Шутов
Савва Иванов
Кинетика сверхбыстрых процессов в молекулах и кластерах
Описание исследований
Для исследования быстро протекающих процессов используются импульсы света фемтосекундной длительности. Такие импульсы создаются с помощью фемтосекундного лазера на титан-сапфире. Лазерные импульсы (800нм) преобразуются с помощью генератора гармоник (400 и 266 нм) и генератора белого света (излучение суперконтинуума 400-1000 нм). Измерения проводятся методом «возбуждение-зондирование» с помощью линии оптической задержки. Первый импульс приводит к возбуждению объекта, второй импульс приходит к объекту с задержкой и используется для анализа состояния в котором находится объект. Изменяя задержку можно получить информацию о процессах происходящих в исследуемом объекте.
В нашей группе проводятся исследования быстропротекающих процессов в люминесцентных зондах и кластерах инертных газов. Отметим, что при использовании лазерных фемтосекундных импульсов легко наблюдаются различные нелинейные оптические процессы, в частности многофотонное поглощение.
Люминесцентные зонды широко используются для измерения различных параметров (температура, концентрация кислорода, pH) в биологических исследованиях, медицине, аэрокосмической промышленности и микроэлектронике. Люминесцентный зонд это молекула (или частица) оптические свойства которой сильно зависят от измеряемой величины. Как правило измеряется интенсивность свечения или время жизни возбуждённого состояния.
Одним из способов значительного улучшения свойств люминесцентных зондов является использование их в составе молекулярных диад. Молекулярная диада представляет собой два хромофорных центра, соединённых небольшим ковалентным мостиком. В такого типа молекулярных системах после возбуждения одного хромофорного центра возможен перенос энергии между хромофорами. Использование молекулярных диад, где хромофоры имеют разные функции и обмениваются энергией позволяет варьировать свойства систем в целом (изменить положение полос поглощения и/или эмиссии, увеличить/уменьшить диапазон измерений и.т.д.). Наши исследования направлены на определение механизмов передачи энергии в молекулярных диадах, находящихся в электронно-возбуждённом состоянии.
Кластеры инертных газов являются удобным объектом модельным объектом для изучения процессов релаксации в многоатомных системах. Для целого ряда многоатомных систем, находящихся в электронно-возбуждённом состоянии основным механизмом релаксации являются безызлучательные процессы. Как правило, их скорость значительно превышает скорость радиационного распада. В многоатомных молекулах со сравнительно большими энергиями связи между атомами основным и часто единственным механизмом безызлучательной релаксации является электронно-колебательное взаимодействие. В кластерах (многоатомных молекулах, нанокаплях) со сравнительно небольшими энергиями связи между атомами появляются дополнительные каналы релаксации (десорбция атомов, ионизация, фрагментация). При этом доминирующий канал релаксации зависит не только от энергии связи между атомами, но и от размера объекта и энергии возбуждения. Несмотря на активное изучение данных процессов в кластерах даже качественные механизмы релаксации на сегодняшний день не всегда ясны. В кластерах ксенона нами был обнаружен ICD-подобный процесс. Данный процесс возможен при одновременном возбуждении двух атомов входящих в кластер. Перенос энергии между двумя соседними возбужденными атомами приводит к ионизации кластера. Характерное время ионизации кластера ксенона в этом процессе составляет ~ 5 пс.
Основные публикации:
P.Y. Serdobintsev, A.S. Melnikov, A.A. Pastor, N.A. Timofeev, M.A. Khodorkovskiy, J. Chem. Phys., 2018, V.148, 194301
I. Balmaev, P. Serdobintsev, A. Melnikov, A. Pastor, M. Khodorkovskiy, Journal of Physics: Conference Series 1410 (1), 012135
Kisel K.S., Melnikov A.S., Grachova E.V., Hirva P., Tunik S. P., Koshevoy I.O., Chemistry–A European Journal, 2017, V.23, P.11301-11311
Belyaev A., Kolesnikov I., Melnikov A.S., Gurzhiy V.V., Tunik S.P., Koshevoy I.O., New Journal of Chemistry, 2019, V.43, P.13741-13750
Рис. 1. Люминесценция в водном растворе флуоресцеина при двухфотонном возбуждении 800 нм
Рис. 2. Настройка генератора белого света
Рис. 3 Аппаратная функция, измеренная по эффекту наведённого двулучепреломления. Ширина на половине высоты 98 фс
Рис. 4. Эксперимент "возбуждение-зондирование" в струе спиртового раствора Кумарина
Руководитель группы
Алексей Сергеевич Мельников, к.ф.-м.н.
amelnikov-noc@ya.ru
Павел Юрьевич Сердобинцев, к.ф.-м.н.